羊肚菌菌种生产中平皿的使用

　　传统母种的生产以试管(斜面)为准，因此母种也被称之为试管种。

　　食用菌生产中，试管被用于进行母种生产主要是因为管口较小不易污染，且在存放和观察方面比较方便。依据菌种保藏、活化和生产等目的的不同，常使用15×150mm、18×180mm和20×200mm等大小不同的规格试管。如在羊肚菌母种的生产操作中通常以18×180mm规格的试管为宜，一支试管可进行6-8瓶原种的转接。小规格试管接种量则不够，大试管则操作不便。

　　在实际的生产和科研中，也有使用平皿进行母种的培养，优势是平皿容积较大，是试管生产量的数倍;且开合方便，便于大规格生产。但缺点是操作难度较大、不易掌握;在科研中，平皿培养在菌种分离、菌丝形态观察、菌株鉴别、活力检测中也优势明显。下面就平皿在羊肚菌菌种生产中的使用进行详述：

　　平皿的种类和选择

　　平皿，也被称为平板、培养皿，分玻璃制品或塑料制品。玻璃制品可反复清洗灭菌使用，塑料制品通常为无菌的一次性产品。平皿呈上下两部分扣合而成，称为一套。研究和生产中常以直径9cm规格的平皿为宜，另有12cm直径，但不要超过15cm，大平皿的单手开合动作更为复杂。

　　塑料平皿通常是已经经过环氧乙烷或伽马射线消杀处理过的无菌产品，储存在密封的塑料袋内，一次性使用，不可反复灭菌再用。相对应的玻璃平皿则可以反复清洗，晾干、灭菌后使用。

　　玻璃平皿的灭菌

　　玻璃平皿的灭菌可以选用高压蒸汽灭菌或干热灭菌。

　　高压蒸汽灭菌的灭菌方法和常规试管斜面或培养基的灭菌方法相同，用牛皮纸或双层旧报纸或平皿灭菌专用不锈钢铁桶将清洗干净并晾干的平皿，按照一套套的包扎捆绑，置于高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌30min，之后置于50℃烘干机中烘干24h后使用。在使用前所有的平皿都被牛皮纸或旧报纸捆扎严实，不与外界直接接触，且必须烘干彻底。

　　干热灭菌是实验中玻璃制品的常用灭菌方法，具体操作是将清洗晾干的平皿按照一套套的装入灭菌铁桶中，或用牛皮纸捆扎(不可用报纸，报纸不耐高温)，置于干热灭菌柜，165℃灭菌4h;冷却后使用。

　　固体培养基的制备

　　平皿培养所用的培养基为固体培养基，需要单独配制。常用的培养基是PDA(土豆-葡萄糖-琼脂培养基)培养基，培养基配制完成后分装200mL置于250mL规格的三角瓶内，封口膜封口后高压蒸汽灭菌，冷却后使用或保存备用。

　　平皿培养基制作

　　首先将灭好菌的平皿或一次性平皿(不拆封)、酒精灯、打火机等操作用具置于超净工作台内，打开紫外灯，消杀20~30min;关闭紫外灯，打开风机，吹风10-15min;打开白灯，开始后续的倒平皿操作。

　　在超净工作台内消杀的同时，将前期制作的固体培养基在微波炉或电炉上彻底溶解，待温度降至50~60℃时(手能承受的最高温度)，开始下一步重要操作：倒平皿(以下操作均在超净工作台内完成)：双手和工作台面用75%的酒精棉球擦拭消杀;打开酒精灯;解开捆扎的平皿置于一边，打开冷却至50~60℃的培养基;左手单手拿平皿和开合盖子(小拇指和无名指弯曲托着底盖，中指其固定作用，大拇指和食指张开，起着开合上盖的作用，上盖的开口方向在酒精灯火焰位置)，右手拿培养基的三角瓶，将培养基倾倒于平皿内;平皿倾倒完成之后，盖子扣合完整，置于台面内冷却备用。每个平皿倾倒15mL左右，200mL固体培养基制作13-14个平皿为宜。倒好培养基的平皿扣合完整平置于实验台面冷却凝固后使用。

　　菌种接种

　　冷却彻底的平皿开始接种作业，接种同样在酒精灯火焰周围无菌操作，首先左手拿活化的菌种管口在酒精灯火焰上轻微过火2~3秒进行消杀;右手拿接种针，接种针在火焰上灼烧灭菌后，右手小拇指、无名指和中指配合打开左手试管的试管塞，试管口继续在火焰上灼烧2~3秒，在近火焰周围用接种针钩取菌种块出来，保持菌种块在接种针上不动，将试管塞盖好后放在工作台上;左手空闲下来拿起冷却的平皿，按照前面倾倒培养基的动作打开盖子，将菌种置于平皿中间，盖上盖子;接种针继续在火焰上灼烧灭菌，接种完毕。接种后的平皿需要用封口膜封口固定，优选商用具透气性的封口膜。封口后置于恒温培养箱内倒置培养。

　　平皿接原种操作

　　羊肚菌长速较快，在23℃恒温状态下，通常3-4天可长满9cm直径的平皿，5-7天可以使用。健壮的平皿菌丝长势均匀，气生菌丝量适中均匀，颜色白色至黄白色，菌核白色细小(长期培养，菌核增大变黄)。

　　平皿接原种，同样在超净工作台内完成，通常使用双人双面超净工作台。超净工作台消杀后，两人(或四人)对坐，一人负责从平皿中挖取菌种、放置菌种至原种瓶内，具体的动作流程和前面培养基倾倒和接种流程近似;另一人则负责开合原种瓶盖子。两人配合完成作业。