北虫草液体菌种制作技术

　　一、培养基配方

　　配方：玉米粉1%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.1%、水95.35%、硫酸镁0.05%、维生素B1 10mg、PH值调至6.5左右。

　　二、制作培养方法

　　❶ 制作一级摇瓶种：将这些原料溶于水后装在500毫升三角瓶中，每个三角瓶装量200毫升，放入玻璃珠3粒左右，塞紧棉塞，然后用4层纱布罩住棉塞、瓶口扎紧，放在高压灭菌锅内进行消毒，待压力表上升至0.5kg/cm2压力时，即放净冷气待指针降至0后，再关掉放气阀门，待温度表指针逐渐上升至1.1kg/cm2后就开始保温30分钟后，慢慢下降指针至0，然后开盖冷却至常温，再移入接种箱或超净工作台等待接种。

　　❷ 接种方法：先把灭菌后的北虫草液体菌种培养基移放在超净工作台上，并把北虫草母种和接种勾、酒精灯、酒精棉球等接种物品也放在超净工作台上，工作服挂在接种室消毒。然后在接种室点燃烟雾剂(用臭氧消毒器更好)，立即关闭所有门窗密闭消毒，同时打开紫外线灯，待40min后，将烟雾放净，关闭紫外线灯，接种人员就可进行接种。接种方法是穿好工作服，打开超净工作台风机，点燃酒精灯，左手拿着母种试管对准火焰口，右手拿着铁勾在酒精灯火焰消毒3-5秒种后立即伸进母种试管内把菌种分成5-7段，再用左手迅速将纱布瓶盖打开，右手立即把一段菌块勾入瓶内(每瓶接入5-6片0.5平方厘米大小菌种)速将瓶盖按原样盖紧。

　　当北虫草菌种接好后，移入22-24℃恒温培养室，摇床震荡发菌培养。摇床转速140r/min，经过4-6天的发菌培养，经检查北虫草菌液的颜色开始清亮、菌球密集，瓶口闻有很浓的北虫草气味，可判断为菌种优良。如发现发菌瓶内浓度低、气味臭，并有五颜六色的菌液，就是有杂菌污染，坚决不能用。

　　❸ 制作二级摇瓶：培养基同一级，用5000ml三角瓶装量2000ml北虫草液体菌种，灭菌冷却后把一级摇瓶种按10%无菌操作接入大摇瓶，22-24℃，140r/min震荡培养72小时后，菌球大小均匀、密度80%以上，菌液清亮，气味清香、无污染的即为合格菌种。由于5000ml大摇瓶体积较大，用手提高压锅放不下，用大锅又太浪费，为解决大摇瓶灭菌问题，可选用100升立式电加热自控高压灭菌锅，一次可灭4个5000的大摇瓶。

　　❹ 菌种稀释：发好的虫草液体菌种接种前需要稀释以扩大接种规模。稀释倍数依据接种的盘数按5-8倍稀释。用稀释罐稀释时，按液体罐空消、实消操作规程：

　　(A)发酵罐空消

　　发酵罐空消(内胆、过滤器、管线的消毒)是对发酵罐进行设备消毒灭菌的过程，对于放置一周不用的发酵罐或者是因为停电使空压机(打气泵)停止运转的发酵罐都需要进行发酵罐的空消操作，具体操作方法：

　　(1)关闭发酵罐，除夹套排气门外的所有阀门，拧紧发酵罐罐口盖子。

　　(2)启动电源，打开控制柜“灭菌”键，此时进入灭菌状态。

　　(3)当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门，此时给夹套升温升压，当夹套压力达到0.05Mpa以上时，缓慢打开夹套进过滤器阀门，打开过滤器尾阀门。

　　(4)当过滤器冷凝水排放完毕有蒸汽冒出后微开过滤器尾阀门，缓慢打开进气阀门尾阀门，排放空气管道内的冷凝水，冷凝水排放完毕后缓慢打开进气阀门，使得蒸汽慢慢进入罐体。

　　(5)微开发酵罐排气气阀门，缓慢将发酵罐内的冷空气排放出去，在空消的整个过程中，控制发酵罐排气阀门，使得发酵罐排气阀门有少量蒸汽流通。

　　(6)当控制柜温度显示接近123℃，发酵罐罐内压力接近0.12Mpa时缓慢打开接种管道尾端，将接种管道内冷凝水排放完毕后，保证尾端有少量蒸汽冒出保证蒸汽流通。

　　(7)当温度达到123℃，发酵罐压力达到0.12Mpa时控制柜开始时间倒计时，屏幕上显示温度和倒计时时间，当倒计时时间为0时，控制柜自动报警，此时空消结束。

　　(8)空消结束后，关闭发酵罐加热棒，关闭夹套进过滤器阀门、发酵罐进气阀门、发酵罐接种阀门、接种管道尾端阀门。微开发酵罐排气阀门、夹套排气阀门、发酵罐进气阀门尾阀门、使得夹套和发酵罐的压力慢慢下降，当过滤器压力即将卸完时，打开空压机(打气泵)，使得空气流通过滤器，通过过滤器的空气在发酵罐进气阀门尾阀门排放掉，流过过滤器的空气对滤芯吹30min，使得吹出的空气无水分后备用。

　　(B)发酵罐实消

　　(1)定量加入清水后，打开夹套排气阀门和发酵罐排气阀门，启动电源，按下“灭菌”键，此时进入灭菌状态。

　　(2)当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门，发酵罐排气阀门微开，整个发酵罐实消过程中控制发酵罐排气阀门的开度，保证发酵罐罐内冷空气排净并保证有蒸汽流通。

　　(3)当控制柜显示屏幕上显示温度123℃，压力表压力0.12 Mpa时控制柜自动倒计时，屏幕上可显示发酵罐温度和倒计时时间，当时间倒计时为0时，控制柜自动报警，打开夹套排气阀门，发酵罐排气阀门，使得夹套和发酵罐压力缓慢下降(发酵罐压力不能掉零)此时发酵罐灭菌结束。

　　注意：计时开始时和灭菌即将结束时需要对发酵罐进行排水操作，微开接种阀门，有少量气、水排出即可，每次排水时间3-5min。排水的目的一是排出阀门处的生水;二是对阀门管路进行灭菌。

　　定量加入清水123℃灭菌40分钟，冷却至20度，使用空压机保持正压，无菌操作方法倒入摇瓶种，无菌空气搅拌均匀，罐内升压至0.5mpa接种(接种与液体接种操作相同)，接种量50-60ml。接种后18-21℃避光培养，好的菌种7-10天封满料面。